ЯНГИ АВЛОД СЭКВЭНС (Sequence) ТЕХНОЛОГИЯЛАРИ

Сир эмаски, ХХI аср улкан имкониятлар, оламшумул кашфиётлар асридир. Турли ахборот ресурслари орқали оламнинг барча мамлакатларида содир бўлаётган ижтимоий-сиёсий янгиликлар қаторида турфа хил ҳайратомуз ихтироларга кунда-кунора гувоҳ бўлмоқдамиз.

Фаннинг қайси соҳасида бўлишидан қатъий назар илгари мавҳум бўлган жумбоқлар бугунга келиб, аста-секинлик билан ўз ечимини топмоқда. Шу жумладан, инсониятнинг эртанги ҳаёти тобора унинг илмий ютуқларига боғлиқ бўлиб қолаётган биологиянинг энг замонавий йўналишларидан бири – геномика фани ҳам жадал суръатлар билан ривожланмоқда.

Албатта, ушбу фаннинг ривожига асосий сабаб бир томондан унинг долзарб эканлиги бўлса, иккинчи томондан, фанга энг яқин кўмакчи ҳисобланган технологияларнинг мунтазам равишда такомиллашиб бораётганидир. Айниқса, бутун бошли организм геномини оддий тилда – ҳарфлар кўринишида ўқиш имкониятини берувчи секвенслаш (нуклеотид кетма-кетлигини акс эттириш) технологиясининг тараққий этиши бу борадаги барча масалаларга ойдинлик киритиб юборди.

Келинг, ушбу технологияр ўтмиши ва ишлаш механизми ҳақида бироз ўртоқлашсак.

Хўш, секвенс технологиялари нима учун керак эди?

1953 йилда Уотсон ва Крик томонидан DNK нинг қўш занжирли эканлиги фанга маълум бўлгач, ирсиятни ўрганишга бўлган иштиёқ кескин ошиб кетди. Табиий фанлар соҳасида фаолият юритаётган барча олимларнинг диққат эътибори эндиликда ушбу ажабтовур молекуланинг ички дунёсини ўрганишга қаратила бошланди. Сабаби ўзида барча ахборотни мужассамлаштирган бу молекулани китобий тилдаги “изоҳи”ни, аниқроқ қилиб айтганда, нуклеотидлар кетма-кетлигини билиш жуда муҳим эди.

Аммо бу унчалик ҳам осон кечмаслигига кўпчиликнинг ақли етиб турарди. Чунки ўша даврда изчил тадқиқотлар учун махсус асбоб-ускуналар мавжуд эмасди. Олимларнинг бор эътибори DNK ни секвенслашга қаратилгани бежиз эмаслиги кейинги тадқиқотлардан аён бўла бошланди. Чунки бу орқали генларни, катта ўлчамли генетик регионларни, тўлиқ хромосома ёки геномни аниқлаш имкони туғилди.

Секвенслаш ёрдамида ўсимлик, ҳайвон, бактерия, арчаеа ва бошқа генетик ахборот манбааларидан ажратилган DNK ёки RNK даги алоҳида нуклеотидлар тартибини (A,C, G, T va U)  билиш мумкинлиги кейинчалик исботланди.

DNK ни секвенсловчи дастлабки метод Рай Ву (Ray Wu) томонидан 1970 йилда Корнелл университетида ишлаб чиқилган бўлиб, у спесифик праймерлар стратегиясига  асосланган методдир.

Бунда дастлаб DNK полимераза ферменти катализланади ва махсус нуклеотид маркаланади. Ушбу метод ёрдамида биринчи бўлиб ламбда фаг DNKси секвенсланди. 1970-73 йиллар оралиғида Рай Ву ва унинг жамоаси махсус синтетик праймерлардан фойдаланган ҳолда, хоҳлаган DNK секвенсини тадқиқ қилиш мумкинлигини кўрсатиб бердилар.

1977 йилда Кембридж университети ходими Фредерик Сенгер (Frederick Senger) ушбу методикани такомиллаштирди. Янги вариантида DNKни тезкор секвенс қилиш мумкин эди. Сенгер ушбу илмий янгилигини шу йили “DNK занжирини тўхтатувчи ингибиторлар ёрдамида секвенслаш” китобини чоп этиш орқали оммага эълон қилди.

Аввалроқ Ҳарвард университети ходимлари Волтер Гилберг (Volter Gilberg ) ва Аллан Максамлар (Allan Maksamlar) ҳам DNK секвенс методикаларини яхшилашга уриниб кўрган олимлар сифатида фанда из қолдирган эди. Уларнинг ёндошуви кимёвий парчаланиш орқали DNKни секвенслашга асосланади. 1973 йилда бу икки олим “кўчманчи-жой таҳлили” номи билан аталувчи методика ёрдамида 24 асос жуфтлигини секвенс қилганликларини маълум қилдилар.

Секвенслаш борасидаги ўзгаришлар вирусларни ҳисобга олмаганда бошқа барча манбалардан DNK ажратиш асосида рекомбинант DNK технологиясини такомиллашувига ёрдам берди. Юқоридаги тадқиқотчилардан ташқари дунёдаги бошқа кўпгина олимлар ҳам DNK секвенсини яхшилаш борасида қатор изланишлар олиб бордилар, аммо Сенгернинг кимёвий усули “Асл” секвенс методологияси сифатида кейинчалик такомиллашиб борди. У DNK синтези жараёнида махсус нишонланган нуклеотидлар ёрдамида DNKни ўқишга асосланган методология сифатида фанда ўз ўрнига эга бўлди.

Ушбу технологияда DNK локусларини ўқишни бошлаш учун махсус праймерлар керак бўлади ва ҳар бир нуклеотид бир-биридан фарқланувчи флуроцентли рангга эга бўлади. Ушбу секвенс машинаси капиллиар электрофорез номи билан ҳам машхур (Бу Applied Biosystemнинг маркетинг бозори учун 1987 йилда ишлаб чиқарган дастлабки тўлиқ автоматлаштирилган секвенс машинаси эди).  Чунки нуклеотидлар махсус узунликка эга капиллиарлардан ўтиб, лазер нури ёрдамида дитекторда чақнаган флуроцент нурларга асосланган ҳолда нуклеотидлар кетма-кетлигини аниқлайди.

Кўплаб инновацион технология ютуқлари натижасида Сингер методи ҳам такомиллашди ва 1000-1200 асос жуфтлигига тенг маълумотларни ўқий олиш имконига эга бўлди. Аммо шунга қарамай, ушбу метод ёрдамида ҳанузгача тўлиқ геномни ўқиш имконига эга бўлинмади.

Кейинги авлод секвенс технологиялари (KAST) ёки бошқача айтганда, юқори сиғимли янги авлод секвенс технологиялари (YAST) – Illumina (Solexa), Roche GS FLX 454, Ion Torent: Proton/PGM ҳамда SOLID секвенаторларини ўз ичига олади.

Ушбу юқоридаги технологиялар бизга DNK ва RNKни аввалги Sanger технологиясига нисбатан юқори тезликда ва аниқликда, шунингдек жуда арзон нархда ўқиш имконини беради. Қолаверса, улар ёрдамида геномни ва молекуляр биологияни революцион даражада тадқиқ етиш мумкин бўлади.

 

Illumina секвенатори

Кейинги авлод секвенс технологияларида катта ҳажмдаги қисқа фрагментлар бир вақтнинг ўзида секвенс қилинади. Буни бажариш учун биринчи навбатда намуналар қисқа бўлакларга тақсимлаб чиқилиши лозим. Ушбу бўлакларнинг узунлиги қайси машинадан фойдаланишга боғлиқ ҳолда фарқланиши мумкин. Illumina секвенаторида 100-150 а.ж. (асос жуфтлиги) катталигидаги DNK бўлакларидан фойдаланилади.

Бироз узунроқ фрагментлар умумий адапторларга уланади ва адаптордан фойдаланган ҳолда, slide (слайд)га маҳкамланади. Полимер занжир реакцияси ҳар бир фрагментни амплификация қилади. Натижада битта фрагментнинг кўплаб нусхалари пайдо бўлади.

Улар кейинчалик секвенс учун ягона занжирга ажратиб чиқилади. Слайд нуклеотидлар ва DNK полимераза билан тўлдирилади. Бу нуклеотидлар рангларга мос флуоресентли нишонланган асосга эга. Уларда шунингдек, терминатор ҳам мавжуд.

Демак, бир вақтда фақат биргина асос қўшила олади. Унда ҳар бир нуклеотид ўқилганда, флоуресент сигнал пайдо бўлади ва бу битта асос қўшилганлигини билдиради. Сўнгида слайд кейинги цикл учун тайёрланади. Терминаторлар йўқотилади ва кейинги асос ўқилиши учун рухсат берилади. Флурисент сигнали кейинги тасвир билан чалкашлик туғдирмаслиги учун у ҳам йўқотилади. Жараён такрорланади, вақти-вақти билан биттадан нуклеотидлар қўшилади. Сўнгра компютер асосларни ҳар бир сайтда ва тасвирда аниқлайди, ҳамда улар нуклеотидлар кетма-кетлигини тузиш учун ишлатилади.

Ҳамма ўқилган секвенсларнинг узунлиги бир хил бўлади, ўқилган секвенсларнинг узунлиги цикллар сонига боғлиқдир.

Roche GS FLX 454 секвенатори

Ушбу секвенатор Illuminaга нисбатан узунроқ фрагментларни секвенс қилиши мумкин. Аммо худди Illumina сингари бу секвенаторда ҳам бир вақтнинг ўзида асослар қўшилганда ҳосил бўладиган кўплаб оптик сигналларни кўриш мумкин. Illumina каби у ҳам DNK ёки RNK ни 1кб гача бўлган қисқа фрагментларга бўлиб юборади.

Умумий адапторлар фрагментнинг тугалланиш қисмига уланади ва улар шарга устун шаклида ўрнатилади. Битта DNK фрагменти битта шарга тўғри келади. Сўнг ушбу фрагментлар адаптор специфик праймерлар ёрдамида амплификация қилинади. Кейин ҳар бир шарча слайддаги биттадан катакчага жойлаштирилади. Демак, ҳар бир катакча биттадан шарча билан тўлдирилади ва ягона фрагментнинг кўпгина нусхалари ҳосил қилинади. Ушбу катакчалар шунингдек, DNK полемераза ферменти ва секвенсловчи буфер билан тўлдирилган бўлади.

Slayd deoksi-nucleotid-tri phosphat (dNTP)ning (Adenin, Guanin, Sitozin, Timin) бири билан тўлдирилган бўлади. Қайердаки улардан бири секвенс яқинида бўлса, у секвенсга уланади. Агар ягона асос такрорланса, кўпроқ қўшилаверади. Шундай қилиб, агар слайдни guanin асоси билан тўлдирилган бўлса, кетма-кетликдаги кейинги ҳарф G бўлади, яъни секвенсга битта G қўшилади. Агар секвенснинг кейинги қисми G G G G бўлса, тўртта G кетма-кет қўшилади. Ҳар бир занжирга қўшилаётган нуклеотиддан сигнал (чақнаш) чиқади.  Сигнал узатилаётган жойлар топилади ва қайси шарчага нуклеотид қўшилганлиги аниқланади.

Слайддаги dNTPli miks ювиб ташланади. Кейинги dNTP қўшилади ва юқоридаги жараён такрорланади. Ушбу цикл барча нуклеотидлар қўшиб бўлингунга қадар давом этади.

Бу турдаги секвенслашда ҳар бир ўқилган секвенс учун график ишлаб чиқилади, сигнал зичлиги кўрсатилган ҳар бир нуклеотид ювиб ташланади. Ҳар бир ювишдаги сигнал зичлиги ҳисобланганда секвенс аниқланади.

Roche GS FLX 454 секвенаторидан турли узунликдаги секвенс фрагментларини олиш мумкин. Чунки ҳар бир сиклга турли сондаги асослар қўшилган. Illumina ва Roche GS FLX 454 дан фарқли равишда Ion Torrent ва Ion proton секвенаторларида оптик сигналлардан фойдаланилмайди.

Аксинча, бу технологияда DNK полимеразага dNTP қўшиш ҳисобига ажралиб чиқадиган H+ ионлари ёрдамида секвенс амалга ошади. Бошқа турдаги янги авлод секвенаторларида бўлгани каби DNK ва RNK ушбу секвенаторда ҳам 200 бп атрофидаги фрагментларга бўлиб олинади. Адапторлар уланади ва битта молекула шарчанинг устига жойлаштирилади. Ушбу молекула эмулцион PZR ёрдамида шарча устида амплификация қилинади. Ҳар бир шарча слайддаги биттадан катакчаларга жойлаб чиқилади.

Roche GS FLX 454 каби ушбу секвенаторда ҳам слайд dNTPдан бири билан тўлдирилади. Шунингдек, буфер ва полимераза ферменти ҳам бўлади. Бир вақтда фақат битта dNTP ишлатилади. Ҳар бир катакнинг pH муҳити текширилади. Ҳар бир H+ радикали ажралганда, pH муҳити пасаяди. pH нинг ўзгариши бизга асосларнинг қанчаси секвенсда иштирок этганлигини аниқлашда ёрдам беради. dNTPлар ювиб ташланади ва жараён бошқа dNTPлар қўшиб чиқилгунга қадар давом этади.

pH нинг ўзгариши ҳар бир циклда нечта нуклеотид қўшилганлигини аниқлашда ишлатилади.

Аввалги технологиялардан афзаллиги. Янги авлод секвенс технологияларининг классик Сенгер секвенаторидан тўртта асосий афзаллик томонлари мавжуд. Улар тезлик, нарх, намуна ҳажми ва аниқлик.

Янги алод секвенс технологиялари Сенгер технологиясига нисбатан сезиларли даражада арзон, тезкор, кам DNK сарфига эга, аниқлик ва ишончлилик даражаси юқоридир. Сенгер технологиясида ҳар бир нуклеотидлар кетма-кетлигини ўқишда катта миқдордаги DNK намунаси керак бўлади. Ҳар бир асосни секвенс қилиш учун бир нечта DNK занжири талаб этилади, уни тугаллашда тўлиқ секвенсни тузиш керак бўлади (мисол учун 100 та асос жуфтлиги учун юзлаб DNK нусхалари, 1000 асос жуфт учун минглаб DNK нусхалари керак бўлади).

Кейинги авлод секвенс технологияларида эса ягона занжирнинг ўзидан секвенс қилиш мумкин бўлади. Бу икки турдаги секвенслашда ҳам cонтиг қуриш ва секвенсни тасдиқлаш учун кўплаб зикзакли нусхалар олинади. Янги авлод секвенс технологияларининг Сенгер технологиясидан икки йўл билан тезкорроқ эканлигини билиш мумкин.

Биринчидан, айрим YAST ларда кимёвий реакция билан сигнал аниқлаш жараёнларини бирлаштириш мумкин. Сенгер технологиясида эса бу икки жараён алоҳида-алоҳида амалга оширилади.

Иккинчи ва жуда фарқ қилувчи жиҳати, Сенгер технологиясида бир вақтда максимум 1 кб маълумотни ўқиш имкони бўлса, YAST ларда эса ҳар бир ягона чипда ва ягона геном ўқишда параллел 300ГБ маълумот олиш имкони мавжуд.

Янги авлод секвенс технологияларида секвенс учун кам вақт сарфланади, ишчи кучи ва реагентлар нархи арзон. Биринчи одам геномини ўқишга кетган ҳаражат 461,42 миллион доллар атрофида эди. Замонавий Сенгер методини қўллаш маълум секвенс маълумотларини олишга бироз кўмаклашган бўлса ҳам ҳанузгача тўлиқ одам геномини секвенслаш учун 9,228 миллион доллар сарф қилинмоқда. Одам геномини Illumina билан тўлиқ секвенслаш эса бугунги кунда атиги 9 228 долларни ташкил этмоқда.

Секвенсдан аввал ҳар бир бўлак амплификация қилиб (кўпайтириб) олинади, чунки YAST лар кўпгина қисқа бўлакларга таянади. Шунинг учун DNK ва RNK нинг ҳар бир бўлаги кўп марта секвенсланади. Чунки бу иш жуда тез амалга ошади ва арзондир. Бу эса Сенгер секвенсидан бир неча марта кўп такрорларни олиш мумкинлиги билан изоҳланади. Кўп такрор бу мукаммал қамров ҳисобланади. Яъни YASTларга хос бўлган аниқроқ ва ишончли секвенслаш усулидир. Сенгер секвенслаш усули ёрдамида узунроқ секвенс олиш мумкин. Аммо YAST лар табиати шуни ифодалайдики, узун секвенсни бир-бирига уланган қисқа секвенслардан ҳам тузиш мумкин. Аниқроқ қилиб айтганда, YAST лар ёрдамида бўлакларга бўлинган DNK фрагментларидан уни тўлиқ секвенс қилиш имкони мавжуд.

Мирзакамол Аюбов

Геномика ва биоинформатика маркази.